光学显微镜（英文Optical Microscope，简写OM）是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。普通光学显微镜是看不到1纳米的。
牵我双手，倾世温柔。
照明光路系统的调整
为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明在显微镜初次安装和调试时就必须把照明光路系统调整好这是正确使用显微镜并获得正确可*结果的重要手段和最基本的要求此外正确掌握照明光路系统的调整是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容
1．照明光源灯室在显微外的初步调整
① 首先将灯室的外壳打开压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中安装时避免手指直接接触灯泡（可用柔软的布或纸隔住）以免灯泡上留有指纹等脏物影响灯泡的使用寿命
②把灯室摆在桌面上接通电源后用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔（标有←→）使灯丝投影在1-2m外的墙上将灯丝成像调至清晰然后调节灯的高低位置调节丝孔（标有──）使灯丝位置高低适当再调节灯的左右位置调节螺丝孔（标有──）使灯丝左右位置合适
2．光源发光体（灯丝）在显微镜内位置的检验和校正 目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明这是调整库勒照明系统的前提条件需要的基本工具对中望远镜购置显微镜时已配备
① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒把灯室装回显微镜上
②选用10×物镜开亮光源程序找样品并调焦清晰再换用40×物镜把样品调焦清晰（40×物镜可以看清灯丝的全貌）
③把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大
④拔掉其中一个目镜换上对中望远镜抓住白色部分另一手伸缩黑色接目镜就可在视野中看到灯丝像
⑤如灯丝位置不合适调──孔把灯丝像沿水平方向调好调──孔把丝像沿垂直方向调好直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像
⑥调整完毕后将毛玻璃套筒插回原位拔掉对中望远镜换回目镜作下一步调整以上所述照明光源灯室在显微镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行平时使用显微镜时不能随意乱调乱动万一调乱时可按上述步骤调回原状
3．库勒照明（Kohler）系统的正确调整 显微镜的正确调试主要工作之一是照明光路系统的调整而其中的关键是库勒照明系统的调整对于每一位使用显微镜的人员特别是作显微照像的人员来说应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握才能充分发挥显微镜应有的功能拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善库勒照明系统的原理简单来说就是光源发光体上任意一点发出的光可以照明显微镜的视域范围而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明调整库勒照明系统的目的是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明防止杂散光对照像系统造成影响或干扰以免照像时在底片形成灰雾高调整库勒照明系统的必要部件视场光阑可进行合轴调整的聚光镜系统
① 选用10×物镜和10×目镜
② 把聚光镜前端透镜摆进光路中孔径光阑调至适中的位置上（不大不小）再把聚光镜升到最顶的位置上聚光镜转盘调至明视野J位置
③ 把视场光阑调至最小（0.1）
④ 载物台上放上已封片的生物样品开亮光源调焦清晰
⑤ 视域中会出现一个局部照明的区域或亮斑这是视场光阑的模糊像在其中可以清晰地看到样品的细节在它之外是较暗的视域不一定能把样品的细节看得清楚
⑥把聚光镜微微地向下调使视野中的亮斑逐渐收小慢慢变成一个清晰的多边形象这便是视场光阑的清晰像
⑦一般情况下多边形象并不在视域中央需要调整聚光镜的一对调中螺丝把视场光阑多边形的像调至中央位置
⑧逐渐开大视场光阑使多边形象成为视域的内接多边形进一步核对调中的状况如对中不够理想继续微微调对中螺丝
⑨将视场光阑稍为再微微开大一些使它的多边形象恰好消失在视域的边缘上至此库勒照明系统调整完毕库勒照明系统调整好以后整个视域照明均匀拍摄的显微照片明亮清晰反差正常在日后使用过程中应特别注意 a. 视场光阑不可任意开大但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小随物镜倍数的减小而开大 b. 聚光镜的高低位置不准乱调否则会破坏已调整好的库勒照明系统 c. 使用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外使用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中 d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题在实际使用过程中作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑但作显微照相时为了避免杂散光线对照相系统的干扰以便能拍摄到较完善的照片则应在使用每一个倍数的物镜时把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上这是比较繁复的工作但又非做不可较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好并作好记号以后使用时根据记号直接调至相应的位置
4．孔径光阑的正确使用 由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率使用时应掌握正确的使用方法过去由于对孔径光阑的认识不足往往把它当作是调节视野亮度的工具虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度但会直接影响成像的反差对比度及分辨率在使用过程中应尽可能避免为了发挥聚光镜孔径光阑的作用以便在观察时尤其在作显微照相时获得最佳分辨率在每换用一个倍数的物镜时在样品调焦清晰后需要调节孔径光阑使它的大小正好等于所用物镜数值孔径（物镜孔径像）的2/3 调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上调节孔径光阑可以看到一个多边形的孔径光阑像然后调到等于物镜孔径像的2/3即介于黑色相差环外与圆形视域内之间为方便起见可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好并作好标记以免每次使用都要重新调整
成像光路系统的调整及显微镜检术概要
显微镜成像光路系统的调整是根据不同显微镜检术的需要而进行的所谓显微镜检术（microscopy）概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法
1．透射光明视野
这是自显微镜发明以来最传统最普遍的应用方法基本部件 a. 物镜任何物镜都可作明视野观察 b. 聚光镜各种聚光镜均可最好配有孔径光阑调整方法在上述显微镜的库勒照明系统调整好后即可应用明视野法适用范围所有已染色的组织切片血液涂片等注意事项 a. 使用明视野方法观察时一定要将库勒照明系统调整好 b. 视场光阑不可任意开大使用10×10×以下和10×以上物镜时要将聚光镜前端透镜分别摆事实出和摆进光路中 c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度更不要乱调聚光镜的高低位置否则会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统 d. 作显微照相时每换用一个倍数的物镜就要调节聚光镜的孔径光阑使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3
2．透射光相差法
这是现代显微镜检术中的一种反差增强法基本部件相差物镜明视野与相差兼用的多用途聚光镜对中望远镜绿色滤光片
调整方法
a. 在库勒照明系统调整好的基础上用明视野方法把样品调焦清晰
b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置选用10×相差物镜换上待观察的透明样品
c. 拔掉其中一个目镜换上对中望远镜并调焦于视野中的两个相差环上（物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环）
d. 视野中的两个相差环不一定重合调节聚光镜上的两个调节装置（调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮）使透光环作前后左右移动而与黑环重合
e. 调整好后换回观察用目镜将绿色滤光片按入光路中即可观察到样品的相差像
f. 有20×和40×物镜观察时聚光镜应设在Ph2位置上用100物镜时聚光镜应设在Ph3位置上
适用范围适用于观察透明未染色或不能染色的样品如各种细胞活组织未染色或不染色的组织切片水生生物等
3．微分干涉相衬法
为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕会掩没掉本来应该看见的细节以及样品或组织切片厚度要求相当薄原则上下能厚于10?m等局限性利用双光束干涉的原理设计子微分干涉相衬法
调整方法
a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才能调好DIC方法
b. 先用10×物镜以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置
c. 把起偏器（polarizer）摆入照明光路中注意其取向应为东西方向
d. 把聚光镜转盘转到与10×物镜对应使用的位置上即DIC 0.30.4
e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜使用的DIC插片（DIC slider）
f. 把检偏器（analyser）插入成像光路中注意其取向应为南北方
g. 换上待观察的透明样品开亮光源把样品调焦清晰
h. 调节DIC插片使微分干涉相衬的像达到最佳效果也就是浮雕效果最为明显
i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑使反差的效果也达到最佳
j. 然后再细微调样品的细节可见样品中不同层面上的结构
k. 如果把补色器（first order red retardation plate）插入并同时调节DIC插片可在视野中看到不断变化的绚丽色彩红橙黄绿蓝紫粉红粉紫及金黄色都具有适用范围透明或不能染色的组织切片厚度可达100?m左右培养中的活组织和活细胞小生生物等
4．落射光激发的荧光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）
简称为落射荧光法是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法它将激发荧光用的光源改在物镜的上方光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察该方法较简便效率高50W的光源强度比透射荧光法的250W还强荧光方法是利用波长较短的紫外光紫光蓝紫光蓝光及绿光等去激发样品只要样品中含有可产生荧光的成分它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光不同物质只能吸改特定波长的激发光而释放的荧光也会有特定的波长因而用作特异性的鉴定十分有效如某些致病的细菌和螺旋体受紫外光激发后能发出它们特有的荧光很容易作出鉴定这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法某些物质自身不会吸收激发光或吸收后不能释放荧光但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光再释放出特定的荧光从而间接地鉴别出某种物质这称为间接荧光法上述荧光方法广泛应用于医学生物学及工业的特异性研究和鉴别上调整方法荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜调整的方法大致相同
① 汞灯的安装
a. 打开包装取出汞灯将其小心安装在上电极散热帽上安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧
b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上再把汞灯的下电极及上电极引线另一端分别安装在灯座上各自的插孔中并固定
c. 锁紧散热片上的螺丝后把汞灯连同灯座及散热帽小心装入灯室中锁紧相应的螺丝再把灯座上的连线和插座插到汞灯电源后部专用的插座上
d. 详细的安装方法请参照有关说明书
② 汞灯灯室在显微镜外的初步调整
a. 接通汞灯电源让汞灯预热10-15min
b. 把汞灯灯室摆放在桌面上让汞弧投影到2-3m外的墙上划一条与灯室窗口中心线对地高度一样的水平线作为参考线
c. 转动灯室调焦旋钮使汞弧的像清晰地投影于墙上
d. 分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔把汞弧的像其反射像调成并排且尽量*近但不要重叠在一起
③汞灯汞弧在显微镜内位置的检验
a. 将汞灯照明光路系统中的视场光阑开到最大
b. 把荧光滤光片组推到蓝光激发的位置上以避免汞灯中的蓝光太刺眼
c. 把观察的样品或一块载玻片放在物台上盖上一张比盖玻片稍大且洁白的薄纸
d. 取下一个物镜使激发的蓝光经物镜转换器的空档照在白纸上白纸上会有一蓝色的圆形照明区域汞弧的像及其反射像都应该出现在这区域的中央部位否则可调节灯室调焦旋钮至最清晰然后分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔直至汞弧的像及其反射像并排在照明区域的中央位置
e. 调好之后把物镜装回去通过目镜可见白纸被蓝光激发后发射出的黄绿色荧光
f. 仔细调焦可看清白纸的纤维取去白纸样品上的荧光细节隐约可见而很容易调焦清晰
④汞灯使用注意事项 通常使用的为50W超高气压汞灯灯管内通有一对钨电极和液态汞（室温下附在管壁上）未点燃时管内气压很低在灯管的两电极间施加电压角发点燃后汞气化为汞蒸气形成汞弧而产生强光温度升高管内气压迅速升到10个大气压由于是高气压的气体放电必须了解其特性才能安全地使用汞灯
a. 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间汞才能充分汽化并形成汞弧产生高亮度而稳定的激发光因此观察前要提早通电
b. 汞灯在使用过程中不要随意开关汞灯的电源
c. 关掉汞灯电源后必须等待15-20min待汞灯自燃冷却后才可再次接通电源违反这一操作规定时将会造成严重后果由于汞灯内的汞蒸气未完全液化汞蒸气内阻很小一旦通电在两电极间施加电压汞灯内形成强大的电流轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈重则汞灯爆炸汞蒸气弥漫整个实验室造成工作人员中毒不仅损失了汞灯还会炸毁灯室内的集光-聚光部件
d. 汞灯的使用寿命一般只有300h使用得当可达600h使用寿命与开关的次数成反比应集中一批样吕作2-3h的观察汞灯价格及昂贵应珍惜使用
e. 汞灯寿命终结的标志是点燃困难灯管发黑
5．暗视野法（dark field）
许多透明或半透明的样品如细菌微生物细胞内的精细结构及结晶体的内含物等在明视野显微镜中不容易看清楚如果采用暗视野法就可以大大提高样品的可视度以暗视野法所看到的是衬托在黑暗视野背景中发亮的样品轮廓及其细节普遍光学显微镜的最高分辨率为0.2μm而暗视野显微镜虽然对样品的细节构造分辨不清楚但却可看到0.004μm以上微细颗粒的存在即可以看到亚显微结构特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等调整方法暗视野法的主要必需部件是暗视野聚光镜使用时须先用明视野聚光镜把库勒照明系统调整好换上暗视野聚光镜时要把载玻片（样品）移开将浸没油滴在聚光镜顶部再把样品载玻片搁在物台上浸没油便充填在两者之间这种聚光镜须与装有可变光阑的100×油镜配用另一种中倍率干式暗视野聚光镜可与中倍率的物镜配用这种聚光镜具有中央光挡照明光只能透过光档与聚光镜边缘之间的透光环才能进入聚光镜内对于配备齐全的相差显微镜与编号为Ph3物镜配用的相差聚光镜相差环可以和10×及10×以下的相差物镜配用而形成低倍率的暗视野效果
（一）必须熟练掌握并严格执行使用规程,按照严格的流程和说明书来操作显微镜。（二）取送显微镜时一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。（三）观察时，不能随便移动显微镜的位置。（四）凡是显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸……阅读全文 >>
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